1.2.6总游离巯基和表面游离巯基测定

蛋清液和不同干燥方式蛋清粉之间蛋白质中总游离巯基和表面游离巯基的区别，摩尔消光系数为13600 M?1cm?1。

1.2.7傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR）分析

用玛瑙研钵将蛋清粉样品磨细，将样品与溴化钾混合，压成片状后测量。25℃下，在4000~500 cm?1的波数范围内对每个样品进行分析。每个样品以空气为背景、KBr为空白对照进行扫描。每次测量都是32次扫描的叠加。用Omnic软件基线校正和傅里叶自取卷积后使用PeakFit软件对1600~1700 cm?1区域进行归一化。利用高斯峰和曲线拟合模型对二级结构组分进行定量估计。

1.2.8溶解度测定

称取0.2 g蛋清粉溶解于20 mL DDW，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH将溶液的pH调节至2.0，4.0，6.0，8.0和10.0，混合溶液在30℃下以100 r/min的转速搅拌30 min，然后7500×g，离心10 min，取上清，用Lowry法测定上清液蛋白质含量。全蛋白含量用蛋白溶解液（20 mmol/L PBS，2%SDS，8 mol/L Urea，pH8.0）充分溶解蛋白样品后的蛋白含量表示。

溶解度(%) =上清液蛋白质含量/总蛋白质含量 ×100%

1.2.9接触角测定

接触角是三相（液、固、气）接触点的切角，是测定粉体润湿性的常用参数。由于润湿行为是一个动态过程，因此可以通过监测接触角的变化率来量化润湿过程。用接触角测量仪测量粉体的水接触角变化。设置的参数为5μL水滴体积和介质滴定速率。记录0~60 s的接触角。每个样品的测量至少重复5次。

1.2.10表面张力测定

采用全自动表面张力仪，以及最大压力法测定不同pH下浓度为1%（w/v）的蛋清溶液表面张力。

1.2.11乳化性和乳化稳定性测定

蛋清蛋白的乳化活性指数（emulsifying ability index，EAI）和乳化稳定性（emulsifying stability index，ESI）测定。制备不同pH（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0）含1%（w/v）蛋清蛋白的溶液，取15 mL溶液与5 mL玉米油混合，在10000 r/min条件下高速均质1 min。分别在0、30 min时从离心管底部取50μL溶液，加入到4950μL 0.1%SDS溶液中，涡旋5 s混匀，立即在500 nm波长处测定吸光度。

为时间差/min；At为放置30 min后吸光度。

1.2.12起泡性和泡沫稳定性

测定蛋清蛋白的起泡性（foaming capacity，FC）和泡沫稳定性（foaming stability，FS），将蛋清蛋白溶液稀释至1%（w/v），调节pH至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，用高速分散器以10000 r/min的速度均质1 min，记录均质前后体积。将样品静置30 min后，再次记录样品体积。

式中：V1为均质前体积（mL）；V2为均质后体积（mL）；V3为均质30 min后体积（mL）。

1.2.13乳液的微观结构分析

1.2.13.1乳液的制备

蛋清蛋白乳液的制备:90 mL含1%（w/v）蛋清蛋白溶液的超纯水作为乳液的水相，10 mL玉米油为油相，10000 r/min条件下高速均质2 min，分别50 MPa高压均质0、1、2次（分别用EWP-P0、EWP-P1、EWP-P2和EWP-D0、EWP-D1、EWP-D2表示）。加入0.02%NaN3作为防腐剂，抑制细菌增长。

1.2.13.2荧光倒置显微镜

用荧光倒置显微镜观察蛋清液及不同干燥方式蛋清粉均质不同次数后乳液的微观结构。取20μL乳液置于载玻片上，并用盖玻片小心的盖住。平衡2 min后，拍摄放大率为400倍下的蛋清蛋白乳液的微观结构照片。

1.2.13.3激光扫描共聚焦显微镜

参考Xu等的方法并作适当修改。将样品用0.1%（w/v）的尼罗红和FITC试剂染色，并在黑暗中孵育10 min。在室温下避光环境中由Leica TCS SP8系统在激发波长为488 nm下（放大倍数为400倍）进行分析。

1.3数据处理

所有的试验均至少重复三次取平均值加减标准差，利用IBM SPSS Statistics 21软件和Duncan多重检验方法对实验数据进行方差分析和显著性分析，并采用Origin 9.0软件处理实验数据及画图。

2.结果与分析

2.1不同干燥方式蛋清蛋白的SDS-PAGE分析

如图1所示，蛋清中主要含有三种蛋白：卵清蛋白（45 kDa）、卵转铁蛋白（76 kDa）和卵粘蛋白。卵粘蛋白主要有α-和β-两个亚基，α-卵粘蛋白又分为两种类型：α1-和α2-，分子量分别为150和220 kDa；β-卵粘蛋白的分子量为400~720 kDa。非还原条件下SDS-PAGE上方出现许多高聚物条带，添加β-巯基乙醇后，高聚物条带消失，表明该高聚物由蛋白通过二硫键聚合而成。蛋清蛋白中原有的卵类粘蛋白与溶菌酶在本实验室并未被检测到，可能是由于卵类粘蛋白在蛋清前处理将稀释、调节pH和搅拌时会发生絮凝，形成白色絮状物，从而被离心除去。溶菌酶的不可逆变性临界点是77℃，因此喷雾干燥（温度高达180℃）过程中溶菌酶可能会变性从而造成损失。此外，冷冻干燥也会造成溶菌酶的损失，如Kudre等在比较日本鹌鹑（Coturnix japonica）和白来航鸡（White Leghorn）冷冻干燥蛋清粉的SDS-PAGE时也发现了冷冻干燥过程中溶菌酶损失的现象。蛋清蛋白各组分在还原条件（图1A）下的分子量略大于非还原条件（图1B），这是因为SDS与蛋白质结合会引起蛋白质构象改变，使蛋白质形成一种长椭圆棒状结构，加入足够量的SDS和β-巯基乙醇可使蛋白质的迁移速率仅与蛋白质分子大小有关。未加入β-巯基乙醇（非还原状态）时蛋白质迁移速度更快可能是因为蛋白质中的二硫键未打开，蛋白质与SDS结合形成长椭圆棒状物的长轴较短，迁移速度更快，因此蛋白质条带的分子量较小。EWP-C、EWP-P和EWP-D蛋白条带几乎没有区别，表明本实验的干燥条件未对蛋清蛋白组分造成明显影响。

图1蛋清液和不同干燥方式蛋清粉蛋白质模式图

注：M.标准蛋白Marker；OVA.卵清蛋白；OVT.卵转铁蛋白；1.EWP-C；2.EWP-P；3.EWP-D。